內(nèi)生真菌( endophytic fungi) 是指生活在植物體 內(nèi)的一類真菌，在寄主中度過全部或近乎全部生活周 期而不使寄主表現(xiàn)任何癥狀，可以經(jīng)對(duì)植物組織內(nèi)直 接擴(kuò)增微生物 DNA 的方式來證明其在內(nèi)部的真實(shí)存。內(nèi)生真菌廣泛存在于植物的健康組織內(nèi)，是植 物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。在長期的進(jìn)化過程 中，一些共存的內(nèi)生真菌與其宿主植物相互建立了特 殊的關(guān)系，這種關(guān)系可以顯著影響植物中有效成分的 形成，從而影響藥用植物的質(zhì)量和數(shù)量。

AE240 分析天平( 瑞士 METTOEＲ TOLEDOGO公司) ; 光照培養(yǎng)箱( 杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司) ; BGZ-240 電熱鼓風(fēng)干燥箱( 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司 醫(yī)療設(shè)備廠) ; 立式壓力滅菌器( 上海博迅實(shí)業(yè)有限 公司醫(yī)療設(shè)備廠) ; BJ-1CD 潔凈工作臺(tái)( 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠) ; LT501E 電子天平( 常 熟市天量儀器有限責(zé)任公司) ; 生化培養(yǎng)箱( 上海博 迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠) ; 振蕩培養(yǎng)箱( 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠) ; FS-1 型可調(diào)高速勻 漿機(jī)( 上海比朗儀器有限公司) ; KDM 型調(diào)溫電熱套 ( 山東鄄城華魯電熱儀器有限公司) ; Ｒ201 旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀( 瑞士布奇 BUCHI) ; e2695 型高效液相色譜儀 ( 美國 waters 公司) ; WND200 中藥粉碎機(jī)( 偉能達(dá) 電器有限公司) 。

毛脈酸模 Ｒumex gmelini Turcz． 種子取自黑龍江 中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振 月教授鑒定。毛脈酸模內(nèi)生真菌，由課題組前期分 離得到菌株 J-G( Plectosphaerella Sp． ) 。 MS 培養(yǎng)基( 不含瓊脂和蔗糖，青島賓得生物技 術(shù)有限公司) ; 瓊脂( 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公 司) ; 無水乙醇( 天津天力化學(xué)試劑有限公司) ; 白藜 蘆 醇 苷 對(duì) 照 品 ( 批 號(hào): MUSH-1616062102，純 度 99． 78% ) 、白藜蘆醇對(duì)照品( 批號(hào): MUSH-12032106， 純度99． 50% ) 均購自成都曼思特生物科技有限公司; 大黃酚-8-O-葡萄糖苷對(duì)照品( 批號(hào): CS1611TZ01，純 度 98%，上海澄紹生物科技有限公司) ; 酸模素對(duì)照 品( 批號(hào): AB161206054，純度 98%，成都埃法生物科 技有 限 公 司) ; 蘆薈大黃素對(duì)照品( 批 號(hào): 110795- 201609，純度98． 1% ) 、大黃酸對(duì)照品( 批號(hào): 110757- 201607，純度99． 3% ) 、大黃素對(duì)照品( 批號(hào): 110756- 200110，純度99． 5% ) 、大黃酚對(duì)照品( 批號(hào): 110796- 201017，純 度99． 6% ) 、大黃素甲醚對(duì)照品( 批 號(hào): 110758-201013，純度99． 8% ) 均購自中國食品藥品檢 定研究院。 

將冷藏于試管中的 毛脈酸模內(nèi)生真菌 J-G 取出，用 75% 乙醇對(duì)試管表 面消毒后，置于經(jīng)紫外滅菌 30 min 的超凈工作臺(tái) 中，用酒精燈灼燒接菌環(huán)的上半部分，待接菌環(huán)冷卻 后，使試管傾斜 45°，將接菌環(huán)伸入試管中，挑取部 分菌絲接入經(jīng)高壓滅菌的新鮮的 PDA 培養(yǎng)基，將接 過菌的新鮮培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱，28℃暗培養(yǎng) 1 周。真菌 J-G 接入經(jīng)高壓滅菌的液態(tài) PDB 培養(yǎng)基中，在震蕩培養(yǎng)箱中 28℃無光條件以 120 r·min － 1 的轉(zhuǎn)速 震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng) 7 d 后，從搖瓶中收獲真菌，用抽濾 機(jī)將菌絲濾出，并用蒸餾水洗滌數(shù)次。將每 10 g 新 鮮真菌生物量重新懸浮于 100 ml 蒸餾水中，通過勻 漿機(jī)強(qiáng)烈機(jī)械攪拌后，高壓滅菌。滅菌的真菌勻漿 作為實(shí)驗(yàn)中的誘導(dǎo)劑。將飽滿的毛脈酸 模種子用 120 目砂紙摩擦后，放入蒸餾水中浸泡 24 h，然后將種子取出，用 75% 的酒精浸泡 2 min，用無 菌水沖洗 3 次，再用 2% NaClO 浸泡 10 min，然后無 菌水沖洗 5次。將處理過的種子接種于無菌的 MS 固體培養(yǎng)基( MS + 蔗糖 + 瓊脂) 上，每個(gè)培養(yǎng)皿 中均勻接入 10 粒種子，用封口膜將培養(yǎng)皿封住，放 置于光照培養(yǎng)箱中在培養(yǎng)溫度( 晝/夜) 25 ℃ /18 ℃、光照周期 14 /10 h、光照強(qiáng)度 3 000 Lx 的條件下 培養(yǎng)，至種苗長出 3 片真葉。以上種子消毒及接到 MS 培養(yǎng)基的過程均需在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。選取 54 瓶長 勢一致的毛脈酸模無菌苗，分 18 組，每組 3 瓶，在潔 凈工作臺(tái)中，用無菌注射器向 27 瓶含有毛脈酸模無 菌苗的錐形瓶中注入制備好的內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子 5 ml，其余 27 瓶作為空白對(duì)照，培養(yǎng)條件與放置于光 照培養(yǎng)箱中在培養(yǎng)溫度( 晝/夜) 25 ℃ /18 ℃、光照 周期 14 /10 h、光照強(qiáng)度 3 000 Lx 的條件下培養(yǎng)，每 5 d 更換一次培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng) 5，10 ，15 d 的時(shí) 候收獲試驗(yàn)組( 各 3 組) 和空白對(duì)照組( 各 3 組) 的 植物根部。

本研究利用內(nèi)生真菌 J-G 誘導(dǎo)子與毛脈酸模幼 苗共培養(yǎng)，在不同培養(yǎng)時(shí)間檢測實(shí)驗(yàn)組幼苗相對(duì)于 空白對(duì)照組的含量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇和白藜 蘆醇苷等二苯乙烯類成分含量顯著提高，酸模素和 蒽醌類成分含量在誘導(dǎo)過程中呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。由此發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)子短時(shí)間( 5 d) 作用對(duì)毛脈酸 模中次生代謝產(chǎn)物的積累具有顯著的促進(jìn)作用。誘 導(dǎo)子是內(nèi)生真菌菌絲滅活制得的，化學(xué)本質(zhì)是無毒 力作用的寡糖、蛋白質(zhì)等，因此不會(huì)對(duì)植株的生長產(chǎn) 生抑制作用，可能由于內(nèi)生真菌的誘導(dǎo)子特異性地 誘導(dǎo)了特定基因的表達(dá)，觸發(fā)植物細(xì)胞間復(fù)雜的反 應(yīng)，導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物的合成和積累。



 

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